توالی یابی، کلونینگ و امکان سنجی بیان ژن اندوگلوکاناز در پروکاریوت

آنزیم اندوگلوکاناز اولین آنزیم از کمپلکس آنزیمی سلولاز است که باندهای داخلی گلیکوزیدی زنجیره‏ی سلولزی را می‏شکند و زنجیره های پلی ساکاریدی مجزای سلولز را به وجود می‏آورد. یکی از بهترین منابع تولید آنزیم اندوگلوکاناز باکتری باسیلوس سابتیلیس می‏باشد که اندوگلوکاناز مقاوم در برابر حرارت تولید می‏کند. در این تحقیق، ژن کد کننده ی آنزیم اندوگلوکاناز خارج سلولی باکتری باسیلوس سابتیلیس بومی جداسازی شده از چشمه‏های آب گرم با استفاده از آغازگرهای دارای جایگاه برشی اختصاصی، حاوی سایتهای برشی xhoi و bamhi جداسازی شده و پس از توالی‏یابی و بررسی خصوصیات، ژن تکثیر شده به ناقل ptz57r/t انتقال داده، سپس وارد باکتری e .coli dh5? شد. غربالگری کلونی‏های حاوی پلاسمید نوترکیب با استفاده از روش انتخابی آبی/سفید و با استفاده از iptg و x-gal صورت گرفت. حضور ژن هدف در ناقل کلونینگ ptz57r/t با استفاده از روش کلونی pcr و هضم آنزیمی تایید شد. سپس ژن اندوگلوکاناز را وارد ناقل بیانی(+)pet-21a کرده و پس از توالی‏یابی و تائید صحت قطعه همسانه‏سازی شده، ناقل بیانی وارد باکتری e. coli bl21(de3) شد. القا بیان به وسیله iptg با غلظت 1 میلی مولار صورت گرفت. صحت بیان پروتئین اندوگلوکاناز با استفاده از روش sds-page تایید شد که باند kd 47 را نشان داد.